استخلاص وتنقية إنزيم الستافلولايسين من بكتريا الزائفة الزنجارية المعزولة محلياً

الباحث

أنوار صباح محمود

المشرف

انتصار حسين علي الموسوي

الجامعة

الجامعة التكنولوجية

الكلية / القسم

قسم العلوم التطبيقية / التقنيات الأحيائية

الشهادة

ماجستير

السنة

2023

لغة الرسالة

عربي

الكلمات المفتاحية

الستافلولايسين; الزائفة الزنجارية; تنقية الإنزيم; التقنيات الأحيائية

في هذه الدراسة الحالية، تم جمع 100 عينة سريرية شملت 25 عينة من مرضى المصابين بالجروح و25 عينة من مرضى المصابين بالحروق و 50 عينة ادرار زرعت على وسط أكار المغذيء وسط الماكونكي الصلب، وسط اكار الدم ، وأكار (CCA) Chromogenic Coliform Agar ووسط سترمايد IS) من ألمستشفيات في بغداد وهي: مستشفى بغداد ألتعليمي ، ومستشفى غازي الحريري ¢ والمختبرات الصحة المركزية ، ومستشفى اليرموك في بغداد / العراق. وقد شخصت العينات بالفحوصات المجهرية والخصائص الزرعية والبايوكميائية Vitek2 system pleas sy ثم فحصت قابليتها على انتاج انزيم الستافيلولاسين ، و أجريت بعدها عمليات استخلاص الانزيم ،ثم حددت الظروف المثلى لإنتاج الانزيم حيث تم تحديد درجة الحرارة المثلى والدالة الحامضية المثلى ،أجريت عمليات تنقية الانزيم التي تضمنت الترسيب بكبريتات الامونيوم 85h3SAmmonium sulfate precipitation اولية ثم الديلزة للتخلص من الأملاح بعدها اكملت التنقية باستخدام عمليات الترشيح الهلامي Gel filtration والتبادل الأيوني Ton exchange وحددت فعالية الأنزيم لكل خطوة تنقية. بينت النتائج إن افضل ظروف مثلى لانتاج الانزيم الستافلولاسين LasA الخام هي عندما تكون درجة الحرارة 37 درجة مئوية والرقم الهيدروجيني 27.3 بوسط خالي من الدكستروز حيث استخلص من الوسط الزرعي عن طريق جهاز طرد ألمركزي حيث اظهرت النتائج باستخدام الترسيب بكبريتات ألامونيوم ان فعالية ألانزيم النوعية كانت 1.278 وحدة / مليغرام بروتين وان افضل نسبة اشباع كانت 80 % وعدد مرات التنقية 8 والحصيلة الانزيمية كانت 13.34 % واظهرت نتائج التنقية بااستخدام كيس الديلزة حيث بلغت الفعالية النوعية للانزيم 1.839 وحدة / مليغرام بروتين وعدد مرات التنقية 1.43 والحصيلة الانزيمية 6.95 96 وكذلك ظهرت نتائج التنقية بااستخدام عامود المبادل الايوني Gus DEDE - Cellulose بلغت الفعالية النوعية للانزيم 9 وحدة / مليغرام بروتين وعدد مرات التنقية 4.3 والحصيلة الانزيمية بلغت 3.19 % واظهرت نتائج التنقية باستخدام عامود ترشيح ألهلامي 0-200 Gus Sephadx كانت الفعالية Age gill الانزيمية 6.72 وحدة / مليغرام بروتين وعدد مرات التنقية 4.9 وبلغت الحصيلة الانزيمية 4.14 % ،حيث ظهرت زيادة في نقاوة الانزيم عند استخدام هذه التقنية عند استخدام عامود الترشيح الهلامي .اظهرت نتائج توصيف الانزيم أن الرقم الهيدروجيني الامثل للفعالية لأنزيم الستافلولاسين LasA يقع عند الرقم الهيدروجيني 8 ورقم هيدروجيني الامثل لثباته يقع بين )7 - 8) ودرجة الحرارة المثلى لفعالية الانزيم تقع عند 35 درجة مئوية ونتائج التبات الحراري الامثل لأنزيم الستافلولاسين LasA يقع بين (25- 35 ) درجة مئوية احتفاظ الانزيم بكامل فعاليته تقريبا. Se lnm. | تم تطبيق الانزيم على SY jell البكتيرية الأربع النقية المستخدمة في هذه الدراسة هي Klebsiella 10 مر Escherichia coli و Acinetobacter baumannii و Enterococcus faecalis وكذلك عزلة الخميرة Candida albicans تراوحت التركيزات ألمثبطة لهذه المضادات ألحيوية التي أستخدمت بالدراسة بين )4 — 32( ميكروغرام / مل ٠، بينما تراوحت التراكيز المثبطة الادنى Minimum Inhibitory 05 لمستخلص(2 -32 ) ميكروغرام / مل لمستخلص انزيم الستافلولاسين LasA وكانت Escherichia coli الأكثر حساسية لمستخلص LasA بسبب انخفاض تركيز المضاد للميكروبات (8ميكروغرام / مل) كان LAS لقتله مقارنةً ب Acinetobacter baumannii ،أظهرت 5¢ لات Escherichia coli و Enterococcus faecalis تأثيرًا تآزريًا لمزيج من إنزيم الستافلولايسين LasA و الجنتمايسسين ،gentamycin الفنكومايسين Vancomycin على التوالي Gus كان قطرالتثبيط لمنطقة العلاج اكبر من قطر منطقة الانزيم والمضاد الحيوي حيث بلغ 137.99 بلنسبة لبكتريا Escherichia coli ولبكتريا Enterococcus faecalis كان قطر التثبيط لمنطقة العلاج 35.29، لكن عز لات Acinetobacter baumannii Klebsiella pneumoniaei ,و Candida albicans أظهرت 1556 مضادًا للمزيج من إنزيم والجنتمايسسين GY Fluconazole Js} slik gentamycin قطر الثبيط لمنطقة العلاج اصغر من قطر مناطق الانزيم والمضاد الحيو.

During the current study, 100 clinical samples were collected, including 25 swabs from patients with wounds, 25 swabs from patients with burns, and 50 urine samples cultured on nutrient agars, solid MacConkie medium, blood culture medium, CCA agar and stramide agar from hospitals in the city of Baghdad, namely: Hospital Baghdad Teaching Hospital, Ghazi Hariri Hospital, Central Laboratories, and Yarmouk Hospital in Baghdad/Iraq. The samples were diagnosed using microscopic examinations, cultural and biochemical characteristics, and using the Vitek2 system device, then their ability to produce the staphylloracin enzyme was examined. Enzyme extraction operations were then carried out. Then, the optimal conditions for producing the enzyme were determined, as the optimal temperature and optimal acid function were determined. Enzyme purification operations were conducted, which included precipitation with ammonium sulfate. Ammonium sulfate precipitation as an initial step, then dialysis to get rid of the salts. After that, the purification was completed using ion exchange and gel filtration processes, and the enzyme activity was determined for each purification step. The results display that the best optimal conditions for the production of LasA enzyme are when the temperature is 37 degrees Celsius and the pH is 7.3 in a dextrose-free medium, where it was extracted from bacterial cells by centrifugation, where the results of purification using the precipitation technique with ammonium sulfate display that the fixed activity of the enzyme was 1.278 units / milligram of protein , and the best saturation rate was 80%, the number of purification times 1.18, and the enzymatic yield was 13.34%, and results of purification were shown employ a dialysis bag, as the fixed activity of the enzyme reached 1.839 units / milligram protein, the number of purification times 1.43, and the enzymatic yield was 6.95%. Ionic DEDE - Cellulose, where the specific activity of the enzyme was 5.49 units / milligram protein, the number of purification times was 4.3, and the enzymatic yield was 3.19%. Where an increase in the purity of the enzyme appeared when using this technique when using a gel filtration column Sephadex( G-200), where the enzyme appeared to be the highest purity in this peak. It varied from results that optimal pH of the activity of LasA is at pH( 8) and the optimum pH of enzyme LasA stability is between (7-8) and the optimum temperature for enzyme activity is at 35 degrees Celsius and the results of the optimal thermal stability of the enzyme of LasA is between (25-35) °C the enzyme retained its activity almost completely. The enzyme was applied to the four pure bacterial isolates used in this study: Klebsiella pneumonia, Escherichia coli, Acinetobacter baumannii, Enterococcus faecalis, as well as the yeast isolate Candida albicans. The inhibitory concentrations of these antibiotics that were used in the study ranged between (4 – 32) micrograms/ml , while the concentrations ranged Minimum Inhibitory Concentrations for extract (2 - 32) μg/ml for the staphylolycin enzyme LasA extract. Escherichia coli was the most sensitive to LasA extract because the low concentration of the antimicrobial (8 μg/ml) was sufficient to kill it compared to Acinetobacter baumannii. Escherichia coli and Enterococcus faecalis isolates showed an effect Synergistic combination of the enzyme staphylolysin LasA and gentamycin, Vancomycin, respectively, where the diameter of inhibition of the treatment zone was greater than the diameter of the zone of the enzyme and the antibiotic, which reached 37.99. For the bacteria Escherichia coli and Enterococcus faecalis, the diameter of inhibition of the treatment zone was 35.29, but for the isolates Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniaei and Candida albican s. The mixture of enzyme, gentamycin, and Fluconazole showed an antimicrobial effect because the inhibitory diameter of the treatment area is smaller than the diameter of the enzyme and antibiotic areas. a1 للا diameter of inhibition of the treatment zone was 35.29, but for the isolates Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniaei and Candida albican s. The mixture of enzyme, gentamycin, and Fluconazole showed an antimicrobial effect because the inhibitory diameter of the treatment area is smaller than the diameter of the enzyme and antibiotic areas.

طلب نسخة من الملف

الملفات غير منشورة على الموقع. اترك بياناتك وسيتواصل معك موظفو قسم الشؤون الثقافية والفنون لإرسال النسخة مجاناً.

الاسم

رقم الهاتف

البريد الإلكتروني

الغرض من الطلب (اختياري)

إرسال الطلب