استخلاص وتنقية إنزيم التانيز Tannase من عزلة محلية جديدة للفطر Helvella bachu وتقييم بعض تطبيقاته البيئية والطبية

الباحث

جيهان موفق سعيد الراوي

المشرف

شمال يونس عبد الهادي

الجامعة

جامعة الموصل

الكلية / القسم

كلية التربية للعلوم الصرفة / قسم علوم الحياة

الشهادة

دكتوراه

السنة

2022

لغة الرسالة

عربي

الكلمات المفتاحية

إنزيم التانيز ; الفطر Helvella ; التنقية ; التطبيقات الطبية

بعد إعتماد المشروع البحثي من قبل اللجنة العلمية ، Lars أن معرفتنا بتنوع الفطريات الكبيرة لا يزال غير مكتمل في ظل غياب الدراسات طويلة الأمد حول عدد الأنواع في موقع محددء كانت أولى الرحلات المسحية في تشرين الثاني لسنة 2021 ولمدة خمسة أشهر وقد شملت مناطق مختلفة من مدينة الموصل والأقضية التابعة لهاء وبإستمرار الرحلات كشف المسح الميداني عن توليفة فريدة متنوعة من الفطريات التي أعطت قدرات مختلفة بالغريلة الأولية عند الكشف عن إنتاج إنزيم Stl وبدأ واضحاً تفوق العزلة ذات الرمز 175 التي أعطت lel قطر لهالة التحلل بلغ 9.2 ملم في غضون 5 أيام. بعد استخلاص الحامض النووي من الخيوط الفطرية واجراء تفاعل البلمرة المتسلسل وتحليل التتابعات النيوكليوتيدية وادخالها في موقع NCBI تبين بأنها تعود للنوع Helvella bachu وبعد صبر وعمل جاد سجلت في بنك الجينات لأول مرة على مستوى العراق وبالمرتبة AS على مستوى العالم بعد العزلة الصينية بالرقم التسلسلي 01454919.1. ومحاكاة للظروف الطبيعية التي تنمو فيها عزلة الفطر المنتخبة، تبين أن الظروف الزرعية المثلى تحققت عند اليوم التاسع على الحضن حيث بلغت الفعالية الإنزيمية 8.62 وحدة / مل، كما أعطى المصدر الكاريوني Tannic acid أعلى فعالية إنزيمية 8.76 وحدة / مل بينما وصلت الفعالية الإنزيمية الى 9.62 وحدة / مل بإستعمال نترات الصوديوم كمصدر نتروجيني، كما بلغت الفعالية الإنزيمية 8.57 و 8.75 و 8.61 وحدة / مل عند الأس الهيدروجيني 5 ودرجة حرارة 30 ”م وسرعة رج 150 دورة / دقيقة على التوالي. أدى إضافة Triton-X100 وأملاح NaCl الى تحسين فعالية الإنزيم إذ بلغت 9.20 و 9.29 وحدة / مل على التوالي. للرغبة في الحصول على إنزيم التانيز المستخلص من عزلة الفطر بصورة نقية اتبعت سلسلة من الخطوات المتعاقبة ومحاليل دارئة، بدأت بتركيز الإنزيم GS الأمونيوم وبنسبة اشباع 75 % أعقبها الديلزة لمدة 24 ساعة ثم كروماتوكرافيا المبادل الأيوني DEAE- Cellulose وأخيرا كروماتوكرافيا الترشيح الهلامي باستعمال Cephadex-G150 التي حققت فعالية نوعية بلغت 95 وحدة / pale بحصيلة انزيمية 57 Yo وعدد مرات تنقية 23.75. سخرت تقنية الاليزا لتكون دليلا على استخلاص الإنزيم وتنقيته حد التجانس حيث بلغ تركيز الإنزيم المنقتى 3050.16 نانوغرام / مل بالمقارنة مع تركيز الأنزيم الخام 460 نانوغرام / مل. أبرزت دراسة خواص الإنزيم عن وزن جزيئي بلغ 52 كيلو دالتون Asis 13 حامض أميني عند الكشف ic بجهاز .Amino acid analyzer وأمتلك الانزيم المنقى فعالية إنزيمية بلغت 8.52 وحدة/ مل عند الأس الهيدروجيني الأمثل 6 في حين كان الأس الهيدروجيني الأمثل لثبات الفعالية يقع بين ( 5 - 6 ). وبدا واضحا أن درجة الحرارة 50 "م هي الأفضل حيث بلغت فعالية الإنزيم 0 وحدة / مل في حين كانت درجة حرارة الات تفع بين 0 - 60 ”م واحتفظ الإنزيم بفعاليته الإنزيمية 98.36 90 عند إضافة ايونات الكادميوم بالتركيز 1.0 ملي مولر. وتبين إمكانية احتفاظ الإنزيم بفعالية إنزيمية بلغت 99.70 7 و 99.23 % بعد مرور 30 و 45 يوما على التوالي عند الخزن ب 4 "م. وأعرب الإنزيم المنقى عن الأحتفاظ ب 92.5 % من فعاليته الإنزيمية عند التقييد بألجينات الكالسيوم. بهدف التقليل أو Gla! التهديدات التي تتعرض لها الأنظمة Atal جاء في طليعة التطبيقات التي استغلت فيها الكتلة الحيوية للعزلة الفطرية المنماة على وسط اللكنين الصلب أحدثت إذابة كاملة لقطع الفحم المنخفض الجودة المنتشرة على سطح الوسط وحولتها الى قطيرات زيتية، وفي الأوساط المغمورة استطاعت الكتلة الحيوية إذابة قطع الفحم وتحويلها الى سائل اسود اللون وأحدثت تغيير في تركيب الفحم كما كشف عنها بطيف الأشعة تحت الحمراء وكروماتوكرافيا الغاز. وجاءت المعالجة الحيوية بأبهى صورها ودقة لم يسبق لها cae إذ ازداد قطر مستعمرة النمو للعزلة الفطرية عند تنميتها على الوسط الغذائي المجهز بالتركيز 1.5 % نفط خام Gus بلغ 10 ملم بعد 7 أيام على التحضين مقارنة بالتراكيز الأخرى Gaby النسبة المئوية للتحلل أعلى قيمة 64.46 Yo بالتركيز Mel وبينت مخرجات التحلل بكروماتوكرافيا الغاز - مطياف الكتلة أهم المركبات الكيمياوية الناتجة من تحلل النفط الخام. نتج عن معاملة النفايات السائلة لمعاصر الزيتون إنخفاض في تركيز الفينول الكلي إذ بلغ 2.14 ملغم / 100 غم بعد مضي 30 يوماً على المعاملة بالتركيز 20 % من مياه الجفت. النسبة المئوية لإزالة اللون الأسود بلغت 64.39 % عند التركيز 10 % وبمدة تحضين 30 يوماً. تمكنت الكتلة الحيوية لعزلة الفطر من خفض متطلب الأوكسجين الحيوي بكلا التركيزين لماء الجفت المستخدم ومدة التحضين مع اختلاف الاستجابات. استغل الإنزيم في مجموعة واسعة من التطبيقات، تمتع الإنزيم المنقى بقدرة على إختزال سم الأفلاتوكسين الأشد خطورة BI حيث بلغت كميته 3.4 نانوغرام / مل و إنخفضت الى 1.2 نانوغرام / مل باستخدام الإنزيم الخام مقارنة بالأفلاتوكسين قبل المعاملة 1.32 مايكروغرام / مل. كما إستطاع الإنزيم الخام المضاف بمقدار 2 مل من إزالة بقع التانين من الإقمشة القطنية بعد 4 ساعة على المعاملة . وعلى نفس المنوال sary تجرية دامت 3 ساعات تمكن الأنزيم من إزالة تانين الشاي الأسود إذ بلغت النسبة المئوية GY التانين 96.77 96. كما أتضح إمتلاك كل من الإنزيم الخام والمنقى القدرة على إعادة تدوير النفايات الورقية وتبييضها مع تفوق إنزيم المنقى بعد 24 dels من المعاملة . وتشير البيانات التي قدمتها Asad إزالة العديد من الأصباغ الصناعية تمكن إنزيم التانيز من إزالة 100 % من لكل من صبغتي Reactive yellow و Indigo Carmina ونسب متفاوتة للصبغات الأخرى المستخدمة بعد 48 ساعة على المعاملة بالإنزيم ولتلافي الرغوة والطعم القابض لبعض العصائرء تمكن أنزيم التانيز المنقى من ترويق كل من عصير السفرجل والتمر الهندي وتحسين المظهر العام بعد مرور 120 دقيقة على المعاملة بالإنزدم. ولأن معظم الإهتمام في الوقت الراهن وجه مباشرة لإستخدام الفطريات في إنتاج مركبات ذات أهمية Ab فقد إتضح أن إنزيم التانيز المنقى يتمتع بخصائص فعالة ضد العديد من الأنواع البكتيرية، إذ أعطى قطر هالة تحلل بلغت 30.5 ملم عند استخدامه بالتركيز 100 مايكروغرام / مل تجاه بكتربا LS .1165516116 pneumonia أظهر تأثيراً مضاداً للأكسدة وقابلية على أكسدة الجذر الحر لمادة DPPH بلغت 80 % عند إستخدامه بالتركيز 500 مايكروغرام / مل. ولتلافي الإستخدام المرهق للأدوية الكيمياوية وفي ظل النقص الحاد لأدوية السرطان تبنت تجرية استخدام الإنزيم المنقى لعلاج سرطان القولون GHT-29 أسفرت نتائج السمية الخلوية بإختبار MTT استهدافه للخلايا السرطانية بنسبة تثبيط بلغت 76 % عند التركيز 500 مايكروغرام / مل في حين لم يكن له تأثير على الخلايا الطبيعية مما يشرع نهجا جديدا لعلاج السرطان ويشكل بارقة أمل تلوح في صراعنا مع السرطان. وللتحري عن الموت الخلوي المبرمج لخط الخلايا السرطانية للقولون أستخدمت الصبغة الثنائية الأكردين اورنج - اثيديوم برومايد وتبين بعد مرور 24 ساعة على المعاملة بإنزيم التانيز قابليته على إحداث الموت الخلوي المبرمج عند فحص الخلايا بالمجهر المتفلور إذ اصطبغت الخلايا الميتة باللون الأحمر. كما كشف التدفق الخلوي بإستخدام الصبغة المتالقة 188-123 عن حدوث JIS في غشاء المايتوكندريا عند المعاملة بأنزيم التانيز بالمقارنة مع الخلايا الطبيعية. وأفضى التحري عن الفعالية المضادة للإلتهاب بطريقة الإمتزاز المناعي المرتبط بإنزيم التانيز وبتتبع تراكيز الأنترلوكين IL-1 و 11-6 في مصل المرضى المصابين بمرض اللوكيميا عن قابلية إنزيم التانيز على خفض مستوى الحركيات الخلوية إذ بلغت 142.0 و24.67 بيكوغرام/مل . أتاح لنا هذا العمل التعرف على عالم الفطريات عن كثب ونأمل أن ما حقق من إنجاز علمي في مهمة شاقة قد يظن الكثيرون انها أقرب الى المستحيل يمثل خطوة رائدة يضاف للنهر الجارف المتجدد يومياً من الإكتشافات العلمية الحديثة املا أن تساهم هذه الرؤية في تسهيل العمل للباحثين الآخرين. Cy

طلب نسخة من الملف

الملفات غير منشورة على الموقع. اترك بياناتك وسيتواصل معك موظفو قسم الشؤون الثقافية والفنون لإرسال النسخة مجاناً.

الاسم

رقم الهاتف

البريد الإلكتروني

الغرض من الطلب (اختياري)

إرسال الطلب