دراسة جزيئية للأغشية الحيوية المنتجة من البكتريا العنقودية الذهبية
Molecular Study of Biofilm Produced by Staphylococcus aureus
- الباحث
- نادية قحطان محمود عباس الشريفي
- المشرف
- نجوى ابراهيم خليل - غادة يونس عبد الرحمن
- الجامعة
- جامعة الموصل
- الكلية / القسم
- كلية التربية للعلوم الصرفة / قسم علوم الحياة
- الشهادة
- دكتوراه
- السنة
- 2022
- لغة الرسالة
- عربي
- الكلمات المفتاحية
- الأغشية الحيوية ; العنقودية الذهبية ; الدراسة الجزيئية ; طب الأسنان
الملخص
جمعت (200) عينة ( 100) مسحة من الانف و (100) مسحة من اليدين للعاملين في مجال طب الاسنان ( 96 اطباء الاسنان و 4 مساعدين ) من كلا الجنسين (61 ذكور و39 اناث) وتراوحت اعمارهم بين( 17- 50 سنة ) في المستشفى التعليمي لكلية طب الاسنان- جامعة الموصل وللفترة من 17 كانون الاول2020 الى 9 شباط 2021. تم تشخيص العزلات بالاعتماد على الصفات المزرعية والفحص المجهري و الاختبارات الكيموحيوية واستخدام جهاز الفايتك Vitek 2 compact لتأكيد نوع العزلة ، cus اظهرت 66 عزلة( 9036.85 ) : 32 ( %37.2( من اليدين و34 ( %36.5 ) من الانفء قابليتها على تخمر سكر المانيتول، وكانت جميع عزلات المكورات العنقودية الذهبية Staphylococcus 17 كانت Lats ،970100 وينسبة Catalase test لاختبار الكتاليز Linge aureus )%53.125( من اليدين و25 )73.52 %( من الانف موجبة لاختبار انزيم التخثر Coagulase test كما تم تشخيص 36 عزلة مخمرة لسكر المانيتول بجهاز الفايتك والتي كانت موزعة على الشكل الأتي : 20 ( %55.55( عزلة من جرثومة S.aureus ;14 عزلة )%63.63( من الانف و 6 عزلات )42.85 %( من اليدين، 5 ( 9013.88 ) عزلات من جرثومة S.lugdunensis :4 ( %18.8( عزلات من الانف وعزلة واحدة )%7.14( من اليدين، 4 (9,11.11) عزلات من جرثومة saprophyticus .3: عزلتين )%9.09( من الانف وعزلتين(7,014.25) من اليدين ، وعزلتين( %5.55( من جرثومة 5.70711735 من اليدين فقط )%14.28(، و 3 ( %8.33( عزلات من جرثومة Swarneri :عزلتين )%9.09( من الانف Aes واحدة(7.14 %( ، من اليدين واخيراً عزلة واحدة ( %2.77( من كل من جرثومتي S.sciuri و Leuconostoc mesenteroides ومن اليدين وبنسبة )%7.14( تم تحديد حساسية عزلات المكورات العنقودية المختلفة لمضاد Oxacillin باستخدام التركيز المثبط الادنى (MIC) وباستخدام جهاز الفايتك وذلك لكون مضاد الاوكساسلين يماثل المثيسلين بالجهاز، وتبين اختلاف العزلات في مقاومتها لهذا المضاد الحيوي اذ كانت اعلى نسبة للمقاومة )%100( لكل من S.lugdunensis و S.sciuri اما S.aureus فقد بلغت نسبة مقاومتها 80 % ثم S.saprophyticus ، S.hominis ، S.warneri %66.67 و %50 و %25 على التوالي . من ناحية اخرى تم تحديد حساسية عزلات المكورات العنقودية للمضادات الحيوية بحسب طريقة Kirby-Bauer وياستخدام سبعة انواع من المضادات الحيوية ‘Rifampicin ،Ciprofloxacin ،Oxacillin ،Methicillin ،PenicillinG Erythromycin ، Vancomycin اذ اظهرت جميع عزلات Staphylococcus مقاومتها | للاوكساسلين والمثيسلين وبنسبة %100 ماعدا عزلات CLS S.saprophyticus نسبة المقاومة %50 للاوكساسلين . اختيرت ست عزلات من aureus .5 لدراسة قدرتها على تكوين الاغشية الحيوية بطريقة اطباق المعايرة الدقيقة Microtiter plate مدعومة بالدراسة الجزيئية وباستخدام تقنية تفاعل البلمرة المتسلسل PCR ء واظهرت النتائج ان العزلات الستة من Staphylococcus aureus لها القابلية على تكوين الاغشية الحيوية لانها تمتلك الجينات icdA وبحجم 188 icaD 5 bp ويحجم 50198 وبنسب مئوية بلغت (83.3 و %100( على التوالي، LS تبين ان )%83.3( من هذه العزلات كانت تحتوي جينات icaA و icaD ، ماعدا عزلة واحدة امتلكت الجين icaD فقط وينسبة )%16.6( ولذلك كونت غشاءً حيوياً بدرجة اقل من بقية العزلات، واظهرت النتائج ايضا ان 9050 من عزلات جرثومة Siaureus كانت مقاومة للمثيسلين وذلك بسبب إمتلاكها للجين mecA ويحجم 60125 المشفر لصفة المقاومة لهذا المضاد الحيوي. وعند التحري عن جينات المقاومة للمضادات الحيوية والمطهرات تبين ان جميع العزلات الستة لم تكن تحتوي على الجين gacA\B وبحجم 501125 ، بينما كانت مالكة للجين 57717 ويحجم 60286 بنسبة مئوية بلغت (9716.6)، تم اجراء اختبار الاقتران باستخدام عزلتين من جرثومة Sawreus والمختلفتين DIL: الوراثية وهي صفات المقاومة للمضادات الحيوية والمعادن الثقيلة وتكوين الاغشية الحيوية وكانت العزلة الواهبة مقاومة للمضاد الحيوي 1 وحساسة للمضاد الحيوي Rifampcin ومقاومة للمعادن الثقيلة وهي كلوريد الزئبق وكلوريد الكادميوم و كلوريد النيكل وكلوريد النحاس ومكونة للاغشية الحيوية اما العزلة المستلمة فكانت مقاومة للمضاد الحيوي 14112102013 وحساسة للمضاد الحيوي 10 وحساسة لكلوريد الزئبق ومقاومة لكلوريد الكادميوم ، كلوريد النيكل وكلوريد النحاس وغير مكونة للاغشية الحيوية وعليه تم اختيار المضاديين الحييوبين Vancomycin و 10 والمعدن الثقيل كلوريد الزئبق لاختبار العزلات الناتجة عن الاقتران، واظهرت هذه العزلة الجرثومية مقاومة للمضاديين الحيوبين Vancomycin و Rifampcin ومقاومة لكلوريد Gal واظهرت قابليتها على تكوين الاغشية الحيوية باستخدام طريقة اطباق المعايرة الدقيقة وبلغ تردد الاقتران 21 10”* وحدة ، وعند التحري الجزيئي عن الجينات المسؤولة عن تكوين الاغشية الحيوية وهي icaA و icaD فكانت النتائج SVC : العزلة الواهبة والمستلمة تمتلك كل من الجينين icaA و icaD معا اما بالنسبة للعزلة الناتجة من الاقتران فتمتلك لجين واحد فقط icaD وعند قياس التعبير الجيني بتقنية GRT-PCR لجيني icaA و icaD المسؤولان عن تكوين البروتينات اللاصقة في الاغشية الحيوية في العزلات المدروسة الواهبة ، المستلمة والناتجة من الاقتران اظهرت العزلة الناتجة من الاقتران اعلى قيمة في التعبير الجيني لهذين الجينين اذ بلغت 2.143547 و2.297397 على التوالي من العزلة الواهية اذ بلغ تعبيرها الجيني (1و1) لكلا الجينين اما العزلة المستلمة فبلغ تعبيرها الجيني 1.414214 و 0.933033 على التوالي ، تم اختيار مادة العكبر Propolis لتحضير المستخلص الكحولي ودراسة فعاليتة المضادة لعزلات جرثومة S.aureus حيث كانت جميع العزلات المستخدمة حساسة له عند التركيز 10/1 مقارنة بالفانكومايسين المستخدم كمقارنة سالبة اذ بلغت نسبة التأثير 0.32288 اما بالنسبة للتراكيز الاخرى المستخدمة في الدراسة وهي 1/1 و 100/1 فكانت العزلات الجرثومية مقاومة لها وبلغت مقاومتها 0.86475 و 0.80613 على التوالي مقارنة مع القيمة المعنوبة المستخدمة .
Abstract
A 200 samples were collected , 100 swabs from the nose and 100 swabs from the hands, of dental workers (96 dentists and 4 assistants ) of both sexes ,61 males and 39 females , their ages ranged from 17 to 50 years in the teaching hospital of the Collage of Dentistry, University of Mosul from the period 17th Dec. 2020 to 9th Feb.2021. The isolates were diagnosed based on culture traits, microscopic examination, biochemical tests, and the use of the Vitek – 2compact device to confirm the the type of isolate 66 isolates ( 36.85%) ;32( 37.2%) of the hands and 34 ( 36.5%) of the nose were capable of fermenting mannitol sugar, and all Staphylococcus aureus isolates were positive for catalase test at 100%, while 17( 53.125%) of the isolates from the hands and 25 (73.52%) of the nasal isolates were positive for the coagulase test. Using the Vitek 2-compact 36 fermented isolates were diagnosed which were distribute as follows 20 ( 55.55%) isolates of S.aureus bacteria; 14 isolates (63.63%) from the nose and 6 isolates (42.85%) from hands, 5 ( 13.88%) isolates of S.lugdunensis;4 isolates (18.18%) from the nose and one isolate (7.14%) from the hands, 4 ( 11.11%) isolates of S. saprophyticus bacteria; two isolate (9.09%) from the nose and two isolate (14.28%) from the hands, 2 (5.55%) isolates of S.hominis (14.28%%) from hands only and 3 ( 8.33%) isolates of S.warneri; two isolates from the nose (9.09%) and one isolate ( 7.14%) from the hands, and finally one ( 2.77%) isolate from each of S.sciuri and Leuconostoc mesenteroides bacteria and from hands with percentage (7.14%). The sensitivity of the different Staphylococcus isolates to oxacillin was determined using minimum inhibitory concentration (MIC) and using the Vitek device because the antibiotic oxacillin is similar to methicillin B in the device, and it was found that the isolates differed in their resistance to this antibiotic, were the highest resistance (100%) was for S.lugdunensis and S.sciuri while for S.aureus its resistance was 80% then S.warneri S.hominis, S. saprophyticus 66.67%, 50%, 25% respectively. On the other hand, the sensitivity of different isolates to antibiotics was determined according to Kirby – Bauer method. And by using seven types of antibiotics Penicillin G, Methicillin,Oxacillin, Ciprofloxacin, Rifampicin, Vancomycin, Erythromycin where all Staphylococcus isolates showed resistance to Oxacillin and Methicillin at percentage 100% except for isolates S. saprophyticus, the resistance was 50% for oxacillin. Six isolates of S.aureus were selected to study their ability to form biofilms by microtiter plate method supported by molecular study and using PCR technique, the results showed that the six isolates of Staphylococcus aureus have the ability to form biofilms because they have genes icaA and size 188 bp and icaD and size198 bp with percentage of ( 83.3 and 100%) respectively, and it was found that (83.3%) of these isolates contained the icaA and icaD genes except for one isolate that possessed the icaD gene only at rate of ( 16.6%) therefore formed a biofilm to a lesser degree than the rest of the isolates, the results showed that (50%) isolates of S.aureus bacteria were resistant to methicillin due to their possession mecA gene and size 125 bp that encodes resistance to this antibiotic,When investigating genes that are resistant to antibiotics and antiseptics, it was found that all six isolates did not contain the gene qacA\ B and size 1125 bp while they possessed the smr gene and size 286 bp with a percentage of (16.6%) and Conjugation test was carried out using two isolates of S.aureus with different genetic markers, which it is the characteristics of resistance to antibiotics, heavy metals and formation of biofilms, the donor isolate was resistant to antibiotics Vancomycin, sensitive to antibiotics Rifampcin and resistant to heavy metals, mercury chloride, cadmium chloride, nickel chloride and copper chloride and composed of biofilm, As for the received isolate it was resistant to antibiotics Vancomycin sensitive to antibiotics Rifampcin, sensitive to mercury chloride resistant to cadmium chloride, nickel chloride and copper chloride and not forming biofilms,therefore antibiotics Vancomycin and Rifampcin and heavy metal mercury chloride were selected to test isolates resulting from conjugation this bacterial isolate showed resistance to mercury chloride and showed its ability to form biofilms using micro titer plates method. The coupling frequency was 21×10-4.Upon molecular investigation of the genes responsible for the formation of biofilms which are icaA and icaD, the results were that the donor and recipient isolate possess both genes icaA and icaD together, As for the isolate resulting from conjugation, it possesses only one icaA gene.And when the gene expression was measured using qRT- PCR technique for the two genes icaA and icaD responsible for the formation of adhesive proteins in the biological membranes in the studied donor, recipient and resulting from conjugation, The isolation resulting from conjugation showed the highest value in gene expression for these two genes as it reached 2.143547 and 2.297397 respectively, from donor isolate as it is genetic expression reached (1and1) for both genes as for the receiving isolate, it is gene expression was reported 1.414214 and 0.933033 respectively. Propolis was selected for the preparation of the alcoholic extract and the study of the antibacterial activity of the S.aureus isolates, as all the isolates used were sensitive to it at a concentration of 1\10 compared to Vancomycin used as a negative comparison as the effect ratio was 0.32288.As for the other concentration used in this study which are 1\1 and 1\100, the bacterial isolates were resistance to it, as their resistance 0.86475 and 0.80613 respectively compared with the significant value used. --- page 173 [OCR+] --- University of Mosul College of Education for Pure Science Molecular study of biofilms produced by Staphylococcus aureus Nadia Qahtan Mahmood Abbas AL-shorify Ph.D. Thesis Biology Supervised by Assist. Prof. Dr.Ghada Younis Abdulrahman Assist. Prof. Dr.Najwa Ibrahim Khaleel 1444 A.H 2022 A.D [OCR of page] University of Mosul , College of Education EMS for Pure Science Molecular study of biofilms produced by Staphylococcus aureus Nadia Qahtan Mahmood Abbas AL-shorify Ph.D. Thesis Biology Supervised by Assist. Prof. Assist. Prof. Dr.Najwa Ibrahim Khaleel Dr.Ghada Younis Abdulrahman 2022 A.D 1444 A.H --- page 174 [OCR+] --- Molecular study of biofilms produced by Staphylococcus aureus AThesis Submitted By Nadia Qahtan Mahmood Abbas AL-shorify To The Council of College of Education for Pure Science University of Mosul In Partial Fulfillment of Requirements For The Degree of Ph.D. In Biology Supervised by Assist. Prof. Dr.Ghada Younis Abdulrahman Assist. Prof. Dr.Najwa Ibrahim Khaleel 1444 A.H 2022 A.D [OCR of page] Molecular study of biofilms produced by Staphylococcus aureus AThesis Submitted By Nadia Qahtan Mahmood Abbas AL-shorify To The Council of College of Education for Pure Science University of Mosul In Partial Fulfillment of Requirements For The Degree of Ph.D. In Biology Supervised by Assist. Prof. Assist. Prof. Dr.Najwa Ibrahim Khaleel Dr.Ghada Younis Abdulrahman 2022 A.D 1444 A.H
طلب نسخة من الملف
الملفات غير منشورة على الموقع. اترك بياناتك وسيتواصل معك موظفو قسم الشؤون الثقافية والفنون لإرسال النسخة مجاناً.