الفعالية المضادة للبكتريوسين المنقى والمنتج من عصيات Bacillus spp. ضد تكوين الغشاء الحيوي لبعض أنواع Acinetobacter spp. المعزولة سريرياً وبعض الجراثيم الممرضة الأخرى

الباحث

آلاء نزار محمود محمد سعيد النجم

المشرف

إسراء غانم حازم السماك

الجامعة

جامعة الموصل

الكلية / القسم

كلية العلوم / قسم علوم الحياة

الشهادة

ماجستير

السنة

2023

لغة الرسالة

عربي

الكلمات المفتاحية

البكتريوسين ; الغشاء الحيوي ; العصيات ; الجراثيم الممرضة

جُمعت )215( عينة من مصادرها المختلفة؛ شملت (160) عزلة سريرية (حروق، ،cae قرح القدم السكريء الإدرارء اللوزتين وسائل النخاع الشوكي) تابعة لجنس Acinetobacter spp. من كلا الجنسين ويمختلف الأعمارء للمرضى المراجعين والراقدين في مستشفيات الموصل ( ابن سينا التعليمي، مركز الموصل التخصصي للحروق والجروح العامة، مستشفى الجمهوري العام)، للفترة من شهر أيلول (2021) ولغاية شهر شباط (2022). كما أستخدمت سلالتين قياسيتين هما النوع Acinetobacter baumannii ATCC19606 والسلالة Salmonella enterica subsp. enterica ser. Typhi ATCC6539 إضافة إلى أرد يع سلالات مشخصة من aud علوم الحياة إجامعة الموصل Methicillin — Resistance Staphylococcus aureus (MRSA) Staphylococcus aureus 5 Klebsiella pneumoniae OP136161 5 و Escherichia -coli أظهرت النتائج أن )160( عزلة ممرضة أعطت )120( عزلة تابعة للجنس Acinetobacter .0 وبأعلى نسبة عزل من الحروق بلغت )%85.7(، الجروح )%75.6( قرح القدم السكري بنسبة )%75( والإدرار من (UTI) والغشل الكلوي )%50( ومسحة اللوزتين )%30.7(، ومن عينات سائل النخاع الشوكي C.S.F )%25(. عزلت العصيات Bacillus spp. من الترب )55( عينة من محافظتي نينوى ودهوك بنسبة )%52.7( انتخبت )11( عزلة من العصيات 5 )13( عزلة من ال.مم5 late! Acinetobacter على الصفات المظهرية (الشكلية والكيموحيوية)، وشخصت أعتماداً على تحديد تتابعات مورشات rRNA 165 إلى 5 سلالات تابعة للنوع B.subtilis -AE وسلالتين للنوع B.cereus -AE وسلالتين للنوع clausii-AE .8 وسلالة واحدة فقط للنوع B.thuringiensis -AE وسلالة واحدة فقط للنوع Bacillus sp.-AE و 8 سلالات تابعة للنوع A.baumannii -AE و5 سلالات تابعة للنوع Glas <A junii-AE 5 سلالات تابعة للنوع B.subtilis -AE و B.cereus -AE في المركز الوطني لمعلومات التقنيات الحيوية National Center for Biotechnology (NCBI) -Information وجدت علاقة تطورية لأنواع Bacillus spp. وتم الحصول على 5 عناقيد العنقود A لسلالات النوع subtilis -AE .8 عند نسبة تشابه )%100( والعنقود 8 لسلالات النوع cereus. -AE .8 عند نسبة تشابه ( 99.8 %( والعنقود C لسلالات النوع clausti -AE .8 عند نسبة تشابه ( %99.6( العنقود (1 لسلالات thuringiensis -AE gsi) .8 عند نسبة تشابه (99.2 %( العنقود E لسلالة النوع Bacillus sp -AE. عند نسبة تشابه )%94.4( ضم أنواع غير مشخصء ued على ثلاث عناقيد للنوع spp. 467761054167 العنقود 4 لسلالات النوع A. baumannii -AE عند نسبة تشابه ( %98.1( والعنقود 8 لسلالات النوع A. junii -AE عند نسبة تشابه ) 98.2 %( وكذلك تعنقدت نفسهاعند مستوى تشابه )%98.7 ( ضمن العنقود C وذلك باستعمال برنامج Molecular Analysis Genetic Evolutionary (Mega7) وبأستخدام طريقة التعنقد المعدل غير الموزون Unweighted Pair Group Method with .Arithmetic mean (UPGMA) أظهرت الأنواع التابعة لجنس Bacillus spp. قدرة على إنتاج البكتريوسين عند التحري الأولي باستخدام طربقة الخطوط المتعامدة Cross Streak method ضد بعض الأنواع البكتيريا الممرضة الموجبة والسالبة لصبغة كرام بينما أختلف تأثير البكتربوسين من جنس Bacillus spp. = ضد البكتيريا الممرضة بأستعمال طريقة الانتشار بالحفرء وكان أكثرها كفاءة بالتأثير ضد السلالات Acinetobacter baumannii-19AE Acinetobacter junii —20AE 5 و -Acinetobacter baumannii-22AE أظهرت بعض من سلالات Bacillus spp. قدرة على إنتاج الطبقة اللزجة على وسط اكَار الكونكو الأحمر Congo Red Agar إذ كانت )%27.2( من السلالات شديدة الانتاجية 5 )%18.2( متوسطة الإنتاجية 5 )%54.5( غير منتجة ، في حين أظهرت نتائج dak الصفيحة المعيارية (MTP) Microtiter Plate أن )9.09 %( من السلالات منتجة للغشاء الحيوي بشدة. إتضح أن سلالات النوع Levee Acinetobacter spp. شديدة الأنتاج للغشاء الحيوي وبنسبة )%53.8( ومتوسطة الإنتاج للغشاء الحيوي وبنسبة )%46.1( على وسط (CRA وكانت كذلك شديدة الأنتاج بطريقة الصفيحة المعيارية MTP ونسبة )%53.8( ومتوسطة الإنتاج للغشاء الحيوي بنسبة )%46.1(. إستخلص البكتريوسين Bacteriocin وبكفاءة عالية ويوزن (14.2غمم/ 5( Cs السلالة Bacillus sp.~AE في وسط الإنتاجية Synthetic 151 medium بالطريقة المباشرة من طريقة الترسيب، وعند الظروف المثالية في درجة حرارة )37( "م وأس هيدروجيني )7( PH= وتركيز ملح الطعام NaCl )%1(، وفترة تحضين Baal يومين. ظهر التركيز المشبط الأدنى MIC لل Bacteriocin المس تخلص من السلالة Bacillus sp.-AE ضد الأنواع البكتيرية مابين (2500-625)مايكرو غرام /سم” بينما التركيز ما تحت المثبط الأدنى MIC اناو ما بين (1250-312.5) مايكرو غرام /سم* بطريقة التخافيف الدقيقة، إذ تغيرت قابليتها على تكوين الغشاء الحيوي من شديدة الإنتاج إلى غير منتجة بتثبيط التصاقها على الأسطح.ء في حين تبين أن البكتريوسين ثابت حرارياً aly يتأثر فعاليته التثبيطية عند درجة Sha (60)”م لكن فقد فعاليته عند درجات الحرارة )70 ، 80)”م لمدة نصف ساعة. قُدر محتوى البروتين الكلي للبكتريوسين بطريقة لاوري المحورة للسلالة Bacillus sp.-AE ب(600 ملغرام /سم”*) في ظروف تحضين (24 ) ساعة ودرجة حرارة (37)”م وأس هيدروجيني -pH=(7) على أنه مضاد حيوي Bacillus sp.-AE شخص البكتريوسين المستخلص من السلالة إذ كانت قيمة Peptide وهو مركب بروتيني يتكون من ال Mersacidin 65ل بن النوع بينما كان الوزن الجزيئي له TLC بطريقة كروماتوكرافيا الطبقة الرقيقة RE معدل الجريان0.70- من5) كيلو دالتون بتقنية الترحيل الكهربائي على أكار الاكريلاميد مع سلفات الصوديوم dal) Lins Sodium Dodecyl sulphate poly Acrylamide Gel Electrophoresis .(SDS-PAGE GEL)

A Two hundred and fifteen ( ) samples were collected from different sources. The samples included (160) clinical samples (burns, wounds, diabetic foot ulcers, urine, tonsils and cerebrospinal fluid) to genus Acinetobacter spp. from both sexesو different ages, and from out and in patients in various hospitals in Mosul (Ibn Sina Teaching Hospital, Mosul Specialized Center for Burns and General Surgery, Al-Jomhori General Hospital). for the period from September (2021) to February (2022). In addition, two standard strains: Acinetobacter baumannii ATCC19606 and Salmonella entericaa subsp. enterica ser. Typhi ATCC6539 and four previously diagnosed species were used from the department of Biology / University of Mosul included Methicillin- Resistance Staphylococcus aureus(MRSA), Klebsiella pneumoniae OP136161, Staphylococcus aureus, and Escherichia coli. The results showed that out of (160) pathogenic isolatesو (120) isolates belonging to the genus Acinetobacter spp. The highest percentage of isolation was from burns (85.7%), wounds (75.6%), diabetic foot ulcers (75%), urine from UTI and kidney failure (50%), tonsils (30.7%), and from samples of cerebrospinal fluid C.S.F (25%). Bacillus spp. was isolated from (55) soil samples collected from Nineveh and Dohuk Governorates, with an isolation rate of (52.7%). Eleven (11) isolates from Bacillus spp. and (13) isolates from Acinetobacter spp. were selected based on the morphological and biochemical characteristics, and the diagnosis was confirmed based on 16S rRNA gene sequences to (5) strains of B. subtilis-AE, two strains of B. cereus-AE, two strains of B. clausii-AE, one strain only of B.thuringiensis- AE, and only one strain of Bacillus sp.-AE and (8) strains of A. baumannii- B AE and (5) strains of A. junii-AE. Five strains of B. subtilis –AE and B.cereus-AE were given accession numbers in the National Center for Biotechnology Information (NCBI). The evolutionary relationship was determined for Bacillus spp. that was organized in (5) clusters: (A) included strains of type B. subtilis-AE at similarity ratio (100%), (B) included strains of type B.cereus-AE at similarity ratio (99.8%), (C) included strains of type B. clausii –AE at similarity ratio (99.6%), (D) included strains of type B. thuringiensis –AE at similarity ratio (99.2%), (E) included strains of type Bacillus sp.-AE at similarity ratio (94.4%), which indicated that it belongd to another species. Acinetobacter spp. were grouped in to three clusters: (A) included strains of type A. baumannii –AE a similarity ratio at (98.1%), (B) included strains of type A. junii –AE a similarity ratio at (98.2%), (C) included strains of type themselves at a level of similarity of (98.7%), by using (Mega7) Program Molecular Evolutionary Genetic Analysis and Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean (UPGMA).Species of Bacillus spp. showed the ability to produce bacteriocin upon initial screening using the Cross Streak method against some gram-positive and gram-negative pathogenic bacterial species, while The effect of bacteriocins from Bacillus spp. was different against pathogenic bacteria using well diffusion method. The most effective effect was against strains Acinetobacter baumannii-19AE, Acinetobacter junii- AE20 and Acinetobacter baumannii-22AE. Some strains of Bacillus spp. showed the ability to produce a slime layer on Congo Red Agar media as follows: (27.2%) of the strains were highly biofilm producers, (18.2%) were medium biofilm producers and (54.5%) were non-biofilm producers. However the results of the Microtiter Plate method showed ( MTP) showed that (9.09%) of the strains were highly biofilm producers. The strains of Acinetobacter spp. were shown to be highly biofilm- producers (53.8%) and medium biofilm producers (46.1%) on CRA medium, while the results on the Microtiter Plate method shown (53.8%) to be highly biofilm- producers and (46.1%) moderate biofilm- producers. Bacteriocin was extracted with high efficiency and weight (14.2 g/L) from Bacillus sp.-AE using the Synthetic Kl medium by the direct method than the sedimentation method, under optimum conditions at a temperature (37) °C, a pH =( 7), a concentration of NaCl (1%), and two days incubation period. The lowest inhibitory concentration (MIC) of bacteriocin that was extracted from Bacillus sp.-AE against pathogenic isolates was between (625-2500) μg/ml, while the sub MIC concentration between (312.5-1250) μg/ml using micro-dilutions method, as its ability to form biofilm was changed from highly productive to non-productive by inhibiting its adhesion on Surfaces. The bacteriocin isolated was found to be thermally stable and its inhibitory activity was not affected at a temperature of (60)°C, while it lost its effectiveness at temperatures (70, 80) °C for half an hour. The total protein content of bacteriocin was estimated by Lowrey's method for Bacillus sp.-AE to give (600) mg / ml under (24) hour in (37 )° C and at pH=( 7). The bacteriocin extracted from Bacillus sp.-AE was identified as a Mersacidin-type antibiotic. Mersacidin is a protein complex consisting of a peptide; The value of Rf was (0.70) by TLC method, while its molecular weight was approximately less than (5) kDa by Sodium Dodecyl Sulphate Poly Acrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE GEL).

طلب نسخة من الملف

الملفات غير منشورة على الموقع. اترك بياناتك وسيتواصل معك موظفو قسم الشؤون الثقافية والفنون لإرسال النسخة مجاناً.

الاسم

رقم الهاتف

البريد الإلكتروني

الغرض من الطلب (اختياري)

إرسال الطلب