تأثير الذيفان أ المستخلص من السيانوبكتريا Microcoleus sp. HI-ES المشخصة بتحليل الجينوم الكامل على البكتريا المرضية ودودة الشمع الكبرى وبذور نبات اللهانة

الباحث

هبة خليل سعيد يحيى الشكرجي

المشرف

إسراء غانم حازم نهد السماك - محمد فاضل حميد مجيد حداد

الجامعة

جامعة الموصل

الكلية / القسم

كلية العلوم / قسم علوم الحياة

الشهادة

دكتوراه

السنة

2024

لغة الرسالة

عربي

الكلمات المفتاحية

الذيفان أ ; السيانوبكتريا ; البكتريا المرضية ; تحليل الجينوم الكامل

جمعت (150) عينة سريرية من ،shal مسحات الجروح والحروق والخراجات وعينات قشع من مستشفيات في محافظة نينوى تضمنت (السلام التعليمي، ابن سينا التعليمي، الخنساء التعليمي؛ الجمهوري التعليمي؛ مركز الموصل التخصصي Gy pall والجراحة التجميلية) للمدة من شهر نيسان أظهرت النتائج الخاصة لعزل سلالات البكتريا الممرضة عزل )136( سلالة من أنواع بكتيرية شخصت مظهرياً وجزيئياً بالإعتماد على مورث FRNA 165 شخصت الى سلالات (33) Enterococcus faecalis(28) ،Pseudomonas aeruginosa(30) ،Escherichia coli 4 (17) Proteus (8)، Staphylococcus epidermidis(11)، Staphylococcus haemolyticus Serratia marcescens(3)، Serratia spp. )6( ، ظهر تفاوت في نسب ،Spall إذ سادت عينات الإدرار بنسبة )68(% خاصة النوع Enterococcus faecalis ،Escherichia coli Serratia spp. ،Proteus spp. ، تليها عينات الجروح والحروق والخراجات وينسبة (6)63, إذ سادت الأنواع البكتيرية التابعة Staphylococcus ،Staphylococcus haemolyticus ،Pseudomonas aeruginosa epidermidis وأعطت عينات القشع أقل نسبة عزل (6)5؟. تم عزل السيانوبكتريا 52.111-155 Microcoleus من المياه العذبة في منطقة سد الموصل وتم تنقيتها عن بقية أنواع السيانويكتريا بإستخدام وسط 8611 السائل المُدعم بالمغذيات مع إضافة فيتامين Bio واللايسوزايم وبإضافة الأكاروز عوضاً عن الأكار للوسط وششخصت مظهرياً وجزيئياً إعتماداً على المورث rRNA 165 الخاص بها تم تنقية وتشخيص البكتيريا المتعايشة مع Microcoleus sp.HI-ES بالتنمية على وسط MSY! المغذي وشخصت الى النوعين Pseudoxanthomonas sp. HI- ، Brevibacillus sp. HI-ES ES مظهرياً وجزبئياً بالإعتماد على مورث rRNA 165 العام. حُضر وسط إنتقائي مكون من الوسط المغذي السائل المضاف إلى وسط1 BG] وبنسبة 1:1 بعد التشخيص الجزيئي للبكتيريا البيئية المتعايشة مع Microcoleus sp.HI-ES وتم بعد تحديد التركيز القاتل لكل منها إضافة المضادين الميروبينيم والستريتومايسين بتركيز 1000 مايكروغرام/مل و 500 مايكروغرام/مل على التوالي. أظهر glad الأناتوكسين المُستخلص من النوع Microcoleus sp.HI-ES والمشخص جزيئياً وبتقنيات برامج المعلوماتية الحياتية ووكروماتوكرافيا الطبقة الرقيقة تأثيراً واضحاً وملحوظاً على جميع السلالات الممرضة ويأعلى نسبة تثبيطية لنمو النوعدلاء 1061101(:11 ،Staphylococcus تليها Cc I ED Escherichia coli ، Pseudomonas aeruginosa ،Proteus spp.، Serratia spp. على التوالي. Enterococcus faecalis_s بلغ طول الجينوم الكامل للسيانودكتريا Microcoleus sp. HI-ES 4,671,230 مليون قاعدة نكليوتيدية ويمحتوى GO بنسبة 47.7% مُوزع ضمن 6417 قطعة نكليوتيدية (contig) بقيمة NSO تبلغ 1092. تم إيداع تسلسل الجينوم البكتيري الكامل في بنك الجنات العالمي NCBI وبنك الجينات الأورد بي ai, ENA database الجينات الياباني DDBJ تحت رقم الإنضمام -JAPTMT000000000.1 تم gla! وتسجيل كامل تسلسل المُورث DNA gyrase subunit A ويطول 2712 قاعدة نكليوتيدية Microcoleus sp.HI-ESM ، ومورث rRNA 235 ويطول 2908 قاعدة نكليوتيدية، ومورث rRNA 165 ويطول 1500 قاعدة نكليوتيدية في بنك الجينات العالمي NCBI وتحت أرقام الإنضمام052183180.1).، 02179626.1 و OP172860.1 على التوالي. أظهرت نتائج التحليل الجينومي البكتيري للسيانويكتريا Microcoleus sp. HI-ES أنه sa على 6264 منطقة قابلة للتشفير (CDS) بشكل عام و 1623 منطقة أو جين وظيفي فعلي معروف الوظيفة. أظهر تحليل الشجرة الوراثية بالإعتماد على كامل المحتوى النكليوتيدي بإستخدام برنامج TYGS أن الأنواع الأكثر قرد 8 إلى Microcoleus sp. HI-ES هي : Microcoleus. asticus IPMA8 _ (accession no. SRRZOO000000.1), Microcoleus vaginatus PCC 9802 (accession no. NZ_CP031740.1), Microcoleus vaginatus FGP-2 (accession no. AFJCO0000000.1) and Oscillatoria nigroviridis 54.5% 359.8% 559.8% و 61.79 asix3. PCC 7112 (accession no. CP003614.1) وعلى التوالي. أعطت نتائج PCR أن جينوم Microcoleus sp. HI-ES يحتوي المورث anaC-gen الخاص بالذيفان الحيوي الأناتوكسين_ أ بطول bp) 366( وإنه بروتيني التركيب وتم الحصول ولأول مرة على المستوى الجزيئي على تسلسل(826) حامض أميني من خلال برامج المعلوماتية الحياتية <Bioinformatic تم إيداع وتسجيل تسلسل جين (anaA) Anatoxin-a وبطول 509 قاعدة نكليوتيدية، في بنك الجينات العالمي NCBI وتحت رقم الإنضمام (0Q269664.1 كما أظهر تحليل الشجرة الوراثية لتسلسل القواعد النكليوتيدية لمورث anatoxin-a الموجود في Microcoleus sp. HI- ،ES أن هذا الجين أقرب إلى تسلسل القواعد النكليوتيدية لموريث anatoxin-a الموجود في الأنواع ‘Planktothrix agardhii stain PCC 7805 22052111210110 nigroviridis PCC 7112 CF ا Nostoc sp. و Aphanizomenon flosaquae KM1D3 ،Anabaena cylindrica PCC 7122 وعلى التوالي. TCL240-02 بينت النتائج أن الأحماض الأمينية في مسار type 1 Polyketide synthase المُنتجة للمادة الفعّالة anatoxin-a لسلالة 111-115 Microcoleus sp. لها نسبة تطابق عالية %98 مع الأحماض الأمينية لسلالة 7112 .Oscillatoria nigroviridis PCC أظهرت نتائج التحري الحيوي عن تأثير ذيفان الأناتوكسين-أ المُستخلص من .50 Microcoleus HI-ES على بذور اللهانة بأنها سامة لإنبات بذور اللهانة بعد سبعة أيام من المعاملة وعند كافة التراكيز الثلاثة المختبرة (0.22:0.45:0.90) مايكروغرام/مل على التوالي، وكذلك سُمية على يرقات الشمع الكبري في الجسم الحي in vivo ليرقات الشمع الكبرى Galleria mellonella ، إذ أعطى التركيز الأدنى 0.22 مايكروغرام/مل بنسبة قتل )20(% يرقة بعد ساعة من الحقن بالذيفان وأعلى نسبة قتل 0 بعد 24 dels من الحقن، في حين أعطى التركيز 0.45 مايكروغرام/مل نسبة S58 )70(% بعد ساعة من الحقن و )100(% بعد 24 dels من الحقنء بينما أظهر التركيز الأعلى للذيفان 0.9 نسبة قتل 90100 بعد ساعة من الحقن. أظهرت نتائج المقاطع العرضية لأنسجة Galleria mellonella المعاملة بالذيفان الأناتوكسين بعد ساعة من الحقن عند التركيز الأدنى(0.22) مايكروغرام/مل تغيرات نسيجية بسيطة لأنسجة يرقة الشمع الكبرىء في حين أظهر التركيز الأعلى (0.9) مايكروغرام/مل في المقاطع تغيرات نسيجية كالنخر والفجوة الشديدة للخلايا الظهارية العمودية. أظهرت نتائج حقن الذيفان الحيوي الأناتوكسين أ عند كلا التركيز (0.22, 0.90( مايكروغرام/مل بعد )24( ساعة من الحقن تغيرات نسيجية واضحة حيث لوحظ التدمير والنخر في المعي المتوسط والقصبة الهوائية والجسم الدهني Body) 1286) مع وجود خحُطام نخر Necrotic debris) (211) في العمود الفقري للخلايا الظهارية والكأسية وتتسلل أو تتخلل إلى التجويف. Galleria mellonella للهيم اللمفي ليرقة apoptosis ت نتائج التحري عن الموت المُبرمج gli بعد 24 ساعة من التحضين تحطيم Microcoleus sp. HI-ES والمحقونة بذيفان السيانودكتريا اليرقات إذ أعطت نتائج المعاملة بتركيز(0.9) مايكروغرام /مل تحطم الجينوم DNA وتلف وتشضي ل لليرقة إلى قطع صغيرة ويحجم يقارب 250 قاعدة نكليوتيدية. bel نتائج تقنية كروماتوكرافيا الطبقة الرقيقة لفصل ذيفان الأناتوكسين _أ أنه عبارة عن بروتين بمعدل جريان 0.33 عند وضعها في درجة حرارة المُختبر، ويقعة واحدة ذات معدل جريان 0.3 عندما وضعت في درجة حرارة )4(° م Baal ساعتين.

A In this study, (150) clinical samples were collected, including samples taken from urine, swabs from wounds, burns, abscesses, and sputum samples from various hospitals in Nineveh Governorate, including Al-Salam Teaching Hospital, Ibn Sina Teaching Hospital, Al-Khansa Teaching Hospital, Al- Jumhuri Teaching Hospital, and the Mosul Specialized Center for Burns and Plastic Surgery for the period of April (2022) until October (2022). The results of the isolation of pathogenic bacteria showed that (136) isolates of different bacterial species were isolated, including (33) Escherichia coli, (30) Pseudomonas aeruginosa, (28) Enterococcus faecalis, (17) Staphylococcus haemolyticus, (11) Staphylococcus epidermidis, (8) Proteus sp., (6) Serratia sp. (3) Serratia marcescens. There was a difference in isolation rates depending on the type of samples, as urine samples occupied first place with a rate of (68)%, especially for isolates of the bacteria Escherichia coli, Enterococcus faecalis, and Proteus sp. Serratia sp. Followed by samples taken from swabs from wounds, burns, and abscesses, with a percentage of (63)%, while sputum samples gave the lowest percentage (5%). It was noted that the samples taken from skin swabs from wounds, burns, and abscesses were dominated by bacterial species belonging to Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus epidermidis, and Pseudomonas aeruginosa. The sample of the cyanobacteria Microcoleus sp.HI-ES was purified from the rest of the cyanobacteria species using liquid BC11 medium supplemented with nutrients with the addition of vitamin B12 and lysozyme, and by adding agarose instead of agar to prepare solid BC11 medium. A selective medium was prepared consisting of liquid nutrient medium added to BC11 medium after molecular identification of environmental bacteria commensal with Microcoleus sp.HI-ES, which included Brevibacillus sp. HI- ES, Pseudoxanthomonas sp. HI-ES and the antibodies meropenem and streptomycin were added at concentrations of 1000 μg/ml and 500 μg/ml, respectively. In the study on the extraction of anatoxin-A produced from Microcoleus sp.HI- ES, anatoxin A showed a clear and noticeable effect on all pathogenic isolates with the highest rate of growth inhibition for Staphylococcus haemolyticus, followed by Serratia sp. , Proteus sp., Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli and Enterococcus faecalis respectively. The general primer of the 16S rRNA gene was used to diagnose pathological types including Enterococcus faecalis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli, and Proteus sp. Pseudomonas B aeruginosa. Primers specific for the 16SrRNA gene were also used to identify the cyanobacteria Microcoleus sp.HI-ES at a size of 700 base pairs. The length of the complete genome of the cyanobacterium Microcoleus sp. HI- ES is 4,671,230 million nucleotide bases with a GC content of 47.7% distributed in 6417 contigs with an N50 value of 1092. The complete bacterial genome sequence has been deposited in NCBI, the European GenBank database ENA, and the Japanese GenBank DDBJ under the accession number JAPPTMT000000000.1. The entire sequence of the DNA gyrase subunit A (gyrA), 2,712 nucleotide bases long, of Microcoleus sp.HI-ES, the 23S rRNA gene, 2,908 nucleotide bases long, and the 16S rRNA gene, 1,500 nucleotide bases long, has been deposited and recorded in the NCBI World GenBank under the accession numbers OP183180.1. , OP179626.1 and OP172860.1 respectively. The results of bacterial genomic analysis of the cyanobacteria Microcoleus sp. HI-ES contains 6264 coding regions (CDS) overall and 1623 actual functional regions or genes of known function. Genetic tree analysis based on the full nucleotide content using the TYGS program showed that the species most closely related to Microcoleus sp. HI-ES are: Microcoleus asticus IPMA8 (Access No Oscillatoria nigroviridis PCC 7112 (Accession No. CP003614.1 ). With values of 61.7%, 59.8%, 59.8%, and 54.5%, respectively. PCR results showed that the genome of Microcoleus sp. HI-ES contains the anaC-gen gene for the biotoxin Anatoxin_A, with a length of (bp 366) and it has a protein structure. For the first time at the molecular level, a sequence of (826) amino acids was obtained through Bioinformatics programs. The sequence of the (anaA) gene was deposited and recorded. Anatoxin-a, with a length of 509 nucleotide bases, is in the NCBI World GenBank under the accession number OQ269664.1. Genetic tree analysis of the nucleotide base sequence of the anatoxin-a gene found in Microcoleus sp. HI-ES, that this gene is closest to the nucleotide base sequence of the anatoxin-a gene found in the species Oscillatoria nigroviridis PCC 7112, Planktothrix agardhii stain PCC 7805, Anabaena cylindrica PCC 7122, Aphanizomenon flosaquae KM1D3 and Nostoc sp. TCL240-02 and respectively. The results showed that the amino acid in the type 1 Polyketide Synthase pathway produced so far, anatoxin-a, by Microcoleus sp. HI-ES has a high match rate of 98% with the amino test of the isolate Oscillatoria nigroviridis PCC 7112. The results of bioinvestigation showed the effect of anatoxin-A extracted from Microcoleus sp. HI-ES on Lanna seeds was found to be toxic to the germination of Lanna seeds after seven days of treatment and at all three tested concentrations (0.9), 0.45 and 0.22 μg/ml, respectively, as well as toxic to the larvae of the larval wax in vivo. vivo for the greater wax larvae, Galleria mellonella, as the lowest concentration of 0.22 μg/ml gave a larvae kill rate of (20) an hour after injection with the poison, and the highest kill rate of 80% after 24 hours of injection, while the concentration of 0.45 μg/ml gave a kill rate of (70). )% after one hour of injection and (100)% after 24 hours of injection, while the highest concentration of the toxin 0.9 showed a 100% killing rate after one hour and 24 hours of injection, respectively. The results of cross-sections of Galleria mellonella tissues treated with anatoxin an hour after injection with the poison at the lowest concentration (0.22) micrograms/ml showed minor histological changes in the tissues of the greater wax larvae, while the highest concentration (0.9) micrograms/ml sections showed histological changes such as necrosis and severe cell vacuolation. Columnar epithelium. The results of the injection of the biotoxin Anatoxin A at both concentrations (0.90 and 0.22) micrograms/ml after (24) hours of injection showed clear tissue changes, as destruction and necrosis were observed in the midgut, trachea, and fat body, with the presence of necrotic debris. ND) in the spines of epithelial and goblet cells and infiltrates or infiltrates into the lumen. The results of the investigation into apoptosis of the Galleria monella larvae injected with the toxin of the cyanobacterium Microcoleus sp. HI-ES, after 24 hours of incubation, destroyed, damaged, and fragmented the DNA of the larvae. The results of the treatment at a concentration of (0.9) micrograms/ml showed that the genome of the larvae was destroyed into small pieces with a size of approximately 250 nucleotide bases. The results of the thin layer chromatography technique for separating anatoxin_A revealed that it is a protein with a flow rate of 0.33 when placed at laboratory temperature, and one spot with a flow rate of 0.3 when placed at (4) °C for two hours.

طلب نسخة من الملف

الملفات غير منشورة على الموقع. اترك بياناتك وسيتواصل معك موظفو قسم الشؤون الثقافية والفنون لإرسال النسخة مجاناً.

الاسم

رقم الهاتف

البريد الإلكتروني

الغرض من الطلب (اختياري)

إرسال الطلب