تثبيط إنتاج استشعار النصاب في جرثومة Pseudomonas aeruginosa والتحري عن دوره في تعديل الاستجابة المناعية

الباحث

أحمد يوسف سعيد صالح البدراني

المشرف

هيام عادل الطائي

الجامعة

جامعة الموصل

الكلية / القسم

كلية العلوم / قسم علوم الحياة

الشهادة

دكتوراه

السنة

2024

لغة الرسالة

انكليزي

الكلمات المفتاحية

Quorum Sensing ; Pseudomonas aeruginosa ; Immune Response ; Inhibition

من خلال هذه الدراسة تم اجراء تقيم لفعالية تثبيط جزيئات استشعار النصاب المنتجة من قبل جرثومة الزائفة الزنجارية, ودورها في تحوير الاستجابة المناعية في مزارع الخلايا المناعية المحضرة مختبريا من اعضاء الفئران .ترتبط إمراضيه جرثومة الزائفة الزنجارية بعوامل الفوعة التي تنظم التعبير الجيني لها من خلال أنظمة استشعار النصاب المختلفة في البكتريا . في الدراسة الحالية تم جمع (245) عينة ادرار من كلا الجنسين من المرضى المصابين بالتهاب المسالك البولية من مختلف الأعمار في مستشفى ابن سينا التعليمي بالموصل, ولم يتلقوا اي علاج بالمضادات الحيوية, ، Gus تم جمع العينات على مدى سبعة أشهر من اذار إلى sh) 2023. واعتمادًا على نتيجة الزرع ، وشكل المستعمرات، والفحص المجهري للمسحة الرطبة المصبوغة بصبغة جرام، واختبارات الكيمياء الحيوية ومؤشر التحليل (API 20E) . تم الحصول على 8 )%4( عزلات من جرثومة الزائفة الزنجارية من أصل )200( عينة ذات نمو جرثومي ايجابي. وتم استخلاص الحمض النووي DNA للعزلات الثمانية من الزائفة الزنجارية بدرجة نقاء عالية وتم تشخيصها جميعا بواسطة تسلسل جين 71314 165 وتم تقديم أريعة منها إلى المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية كسلالات جديدة. تم الكشف عن قدرة الزائفة الزنجارية على إنتاج جزيئات استشعار النصاب بالطرق المظهرية والجينية, في الطرق المظهرية تم اختيار عوامل ضراوة متعلقة باستشعار النصاب ,الانزيم المحلل للدم، مقاومة المضادات الحيوية، تكوين الأغشية الحيوية وإنتاج صبغة البيوسيانين. جميع عزلات الزائفة الزنجارية التي تم عزلها كانت تمتلك هذا الانزيم حيث قامت بتحليل كرات الدم الحمراء عند نموها على أجار الدم وظهور مناطق شفافة حول المستعمرات النامية. تم استخدام طريقة كيربي باور لإجراء اختبار الحساسية للمضادات الحيوية لمختلف المضادات الحيوية، جميع عزلات جرثومة الزائفة الزنجارية كانت تمتلك مقاومة لأكثر من نوع من المضادات الحيوية التي استخدمت في الدراسة الحالية، وكانت اعلى نسبة مقاومة ابدتها هذه الجرثومة تجاه المضاد الحيوي السيفترياكسون لتصل إلى %100 بينما تم تسجيل معدل مقاومة 12/ فقط تجاه الميروبينيم. تم تحديد قدرة جرثومة الزائفة الزنجارية على تكوين الغشاء الحيوي في دراستنا لجميع العزلات بثلاث طرقء طريقة الصفيحة المعيارية، طريقة الأنبوب الزجاجي وأجار الكونغو الأحمر. كانت نتائج طريقة الصفيحة المعيارية أن 8/6 )775( من العزلات كانت منتجات أغشية حيوية قوية و 8/2 )425( من العزلات كانت منتجات أغشية حيوية معتدلة، Ley أظهرت طربقة الأنبوب الزجاجي أن 8/4 (50/) من العزلات كانت منتجات أغشية حيوية قوية و 8/3 (37/) من العزلات كانت منتجات أغشية حيوية معتدلة و 8/1 )713( لم يتم اكتشاف تكوين أغشية حيوية بهذه الطريقة. وأخيرّاء لم تكن طريقة أجار لص ٌٌٌٌٌٌٌٍُُُُُُْةسةةششمشم ا اا 66 الكونغو الأحمر مفيدّة للكشف عن الأغشية الحيوية في جميع العزلات. بشكل عام إن جميع عزلات الزائفة الزنجارية لديها القدرة على إنتاج صبغة البايوسينين بدرجات مختلفة ill تم اكتشافها باستخدام طريقة مشابهة لطريقة الصفيحة المعيارية . الطرق الجينية شملت على الكشف عن جينات استشعار النصاب 1 las و 1 ON las نظام Las ينظم شبكة واشارات استشعار النصاب في جرثومة الزائفة الزنجارية وكذلك ينظم تكوين الأغشية الحيوية وإنتاج البيوسيانين، وتم الكشف عن وجد هذه الجينات في العزلة التي كانت مقاومة لجميع المضادات الحيوية وكذلك التي تمتلك مقاومة لأكثر من نوع من المضادات الحيوية التي استخدمت في الدراسة الحالية. واحد من أهم الأعمال في هذه الدراسة هو تثبيط تكوين الاغشية الحيوية وإنتاج البايوسينين، وذلك باستخدام ثلاث مواد: فيتامين ث, حمض الساليسيليك والمصل المتعدد (الحاوي على الباروكسونيز). كانت نتائج تثبيط تكوين الأغشية الحيوية بواسطة فيتامين ث ¢ حمض الساليسيليك و والمصل المتعدد هي (76 ، 37 4)28 على التوالي،ء حيث اظهر فيتامين ث أعلى تثبيط ، بينما في تثبيط إنتاج صبغة البايوسينين أظهر حمض الساليسيليك أعلى تثبيط (77/) مقارنة مع المصل المتعدد و فيتامين ث الذي أنتج (56 و 38(% على التوالي. تم استخلاص خام استشعار النصاب بالطرق اليدوية ومن ثم استخدمنا مطياف الأشعة تحت الحمراء وتقنية الكروماتوغرافي السائلة ذات الضغط العالي للتأكد من وجود جزيئات استشعار النصاب في المستخلصء، حيث أظهرد ت النتائج احتوائه homoserine lactone signal فقط. أخيرّاء هناك عمل مهم آخر في هذه الدراسة وهو تقييم دور جزيئات استشعار النصاب في تعديل المناعة، Gilly يظهر من خلال التنظيم السلبي للتعبير الجيني للسايتوكينات البادئة للالتهابات عندما تمت معاملة مزارع الخلايا المناعية بمستخلص استشعار النصاب بتراكيز مختلفة )5< 12.5 و 25(% ومقارنتها بجين ال -housekeeping أجريت هذه التجارب على مزارع الخلايا المناعية والمحضرة في المختبر من الطحال والعقد الليمفاوية ونخاع العظم للفثران. تسببت جميع التركيز في التنظيم السلبي لتعبير IL-1 B) Glas و IL-6 و TNFo. 5 IL-2 و (NF-KB ولكن بدرجات مختلفة عند مقارنتها بجين ال (GAPDH) housekeeping كان أعلى تعديل مناعي في التركيز (25/) في الاعضاء الثلاثة. من هذه النتائج خلصنا إلى أن هناك دور رئيسي لجزيئات استشعار النصاب في إمراضيه الزائفة الزنجارية من خلال تنظيم عوامل الضراوة وتقليل الاستجابة المناعية للمضيف. الجانب المهم في هذه الدراسة هو استخلاص جزيئات استشعار النصاب لأول مرة محليًا واختبار دوره في تعديل المناعة لدى المضيف على المستوى الجينيء وهذا يعتبر الأول من نوعه في العالم.

This study was conducted to evaluate the effectiveness, the inhibition of Quorum sensing (QS) produced by Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) and its role in immune modulation response in immune cell culture prepared from mice organ. The pathogenicity of P. aeruginosa is associated with virulence factors. Various QS systems in bacteria regulate virulence gene expression. In the current study , a total of (245) urine specimen were collected from both sexes of patient with Urinary Tract Infection (UTI), from different ages. At Mosul's Ibn Senna Teaching Hospital, they received no antibiotic treatment. This study will take place between March and September of 2023. Depending on the culture, colony morphology, and microscopic analysis of the wet film, staining with Gram's stain, biochemical identification and Analysis Profile Index 20E (API). Eight (4%) isolates of P. aeruginosa were obtained out of (200) positive growth . DNA of 8 isolates of P. aeruginosa were extracted with high purity and all isolates were diagnosed by 16S rRNA gene sequencing. Four of them were submitted in the National Center for Biotechnology Information (NCBI) as new strains. The ability of P. aeruginosa to produce QS molecules were detected by phenotypic and genotypic methods. In phenotypic we selected virulence factor related with QS, hemolysin, antibiotic resistance, biofilm formation and pyocyanin production. All isolates of P. aeruginosa produced hemolysin through their abilities to hemolyse RBC when growth on blood agar. Kirby- Bauer method was used to perform the antibiotics susceptibility test against different antibiotics. All isolates of P. aeruginosa were multi drug resistance (MDR) The high prevalent resistance to antibacterial drugs, was obviously observed with ceftriaxone (100 %) while only 12% resistance rate was recorded towards to meropenem . The biofilm formation in our study was determined in eight isolates of P. aeruginosa was determined using three methods :Tissue Culture Plate Method (TCPM), Tube method (TM) and Congo red agar method(CRA). The results from the TCPM showed that 6/8(75%) of the isolates were strong biofilm produces and 2/8(25%) of the isolates were moderate biofilm produces,while, TM showed that 4/8(50%) of the isolates were strong biofilm produces, 3/8(37%) of the isolates were moderate biofilm produces and 1/8(13%) no detected biofilm formation by this method. CRA was not beneficial to detect the biofilm in all isolates. In general, all P. aeruginosa isolates had the ability to produce pyocynin with different degrees which was detected using a method similar to TCPM . Genotypic methods included detection of QS virulence genes. Results highlighted that las I and las R genes are important because the Las System regulates the P. aeruginosa QS network as well as biofilm formation and pyocyanin production in P. aeruginosa isolates. One of the important work in this study was the biofilm formation inhibition and pyocynin production by utilizing three materials :Vitamin C (vit C), Salicylic acid (SA) and human multi serra (paraoxonase containing). Inhibition of biofilm formation by vit C, SA and multi serra were 76, 37, 28 % respectively Vit C showed the highest inhibitory, while in inhibition pyocynin production SA showed the highest inhibition for Pyocyanin production (77%) compared with multi serra and vit C that produced 56 and 38 % respectively. The QS crude was extracted with manual methods. Then Fourier- transform infrared spectroscopy (FT-IR) and High-pressure Liquid Chromatography (HPLC) was used to confirm the presence of QS molecules in the extract. Results showed the presence of the homoserine lactone signal (HSLs) molecules as the only member of QS molecules. Finally, another important work in this study evaluated the role of QS molecules in immune modulation which appeared through downregulation for pro-inflammatory cytokines genes expression were revealed when the immune cell cultures were treated with QS crude at different concentrations (5, 12.5 and 25)% and compared to the housekeeping gene. These experiment conducted in immune cell culture prepared from spleen, lymph node and bone marrow for mice. All concentrations caused downregulation for (IL-1 β, IL-6, IL-2, TNFα and NF-KB) genes expression, but in different degrees when compare with (GAPDH) Housekeeping geen.The highest immune modulation was in concentration (25%) in three organs . Through the results, we concluded that there is a major role for QS in the pathogenicity of P. aeruginosa by regulating virulence factors and reducing the host immune response. The significant aspect of this study is extraction of QS for the first time locally and investigate its role in immune modulation of the host for genetic level, this is considered a world first.

طلب نسخة من الملف

الملفات غير منشورة على الموقع. اترك بياناتك وسيتواصل معك موظفو قسم الشؤون الثقافية والفنون لإرسال النسخة مجاناً.

الاسم

رقم الهاتف

البريد الإلكتروني

الغرض من الطلب (اختياري)

إرسال الطلب