التحري الجزيئي عن جينات الفوعة والمقاومة في بلازميدات Proteus mirabilis المعزولة من التهاب المجاري البولية في مدينة الموصل / العراق

الباحث

محمد عبدالرزاق ابراهيم حسن القطان

المشرف

ريان مازن فيصل

الجامعة

جامعة الموصل

الكلية / القسم

كلية العلوم / قسم علوم الحياة

الشهادة

دكتوراه

السنة

2024

لغة الرسالة

انكليزي

الكلمات المفتاحية

Proteus mirabilis ; Plasmids ; Virulence Genes ; Urinary Tract Infections

تم عزل ما مجموعه 37 سلالة Proteus mirabilis من 420 عينة بول من المرضى الذين يراجعون عدة مستشفيات في الموصل / العراق خلال الفترة (من ديسمبر 2022 إلى أبريل 2023). تم تحديد العزلات على أساس الاختبارات الزرعية والمجهرية والكيميائية الحيوية، وتم تأكيدها Le) عن طريق التسلسل الجيني للرنا الرايبوسومي rRNA 165. تم تقديم تسلسل الحمض النووي ل 27 سلالة إلى المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI) كسلالات محلية جديدة تنتمي إلى .2 9 اأظهرت الحساسية للمضادات الحيوية ضد 18 مضاد حيوي أن P. mirabilis كان cle المقاومة للأموكسيسيلين )%100(، يليه التريميثويريم )%97.29( في حين تم الكشف عن انخفاض معدل المقاومة ضد السيبروفلوكساسين والنورفلوكساسين )%13( الإيميبينيم (768) والميرودينيم. )%5( أظهر تحليل الحمض النووي البلازميدي أن 21 من أصل 37 سلالة من P. mirabilis تحتوي على بلازميدات، وسلالتان تحتويان على بلازميدتين و19 سلالة تحتوي على بلازميد واحد. تم استخدام ay} مجموعات من البادئات لتجارب PCR تضمنت المجموعة الأولى البادئات المستخدمة للتعرف على ستة مناطق وراثية وهي ،EBCM 4011 ،DHAM <CITM) 10701 7 ا)أظهرت النتائج أن %85.71 من العزلات حملت FOXM على بلازميداتها 5 %14.28 حملت MOXM و4.76 % حملت 6777114. ومع ذلك، لم يتم الكشف عن 17477 4 ACCM EBCM s على البلازميدات. المجموعة 2 بما في ذلك جينات ،ZapA و1724 (مستقبل حامل الحديد)، hpmA 5 (الهيموليزين)ء 5 .((fimbriae ،mrpA تم اكتشاف ZapA في %80.95 من بلازميدات PL ireA ،ah ،mirabilis بمعدل %76.19، و7274 بنسبة 6%14.28 mrpAs بنسبة °%4.76 المجموعة 3 بما في ذلك .CTXG25_s 017608 ،CTXG2 CTXG9 ،CTXG] وأظهرت نتائجها أن CTX9 كان أعلى جين تم اكتشافه بنسبة 9776.19، يليه CTXGI بنسبة 29671.42 في حين تم اكتشاف CTXG2 و07708) و 0770025 فقط على الكروموسوم. وأخيراً، تم العثور على الجينات المسببة للأمراض PmIJ1 و (0711 على بلازميدات mirabilis .2 بنسبة 9652.38 5 %47.61 على التوالي. أظهرت النتائج الحالية أن البلازميدات تنتشر بشكل متزايد بين العزلات المحلية السريرية لبكتيريا ،<P. mirabilis وبلزم اتخاذ احتياطات جدية. 000ل a اللسلس تم اختبار asl عشر مستخلصًا Lbs وكحوليًا من النباتات الطبية الطبيعية وأربعة جسيمات نانوية لتأثيرها lid) ضد mirabilis .2. أظهرت نتائجنا أن المستخلصات المائية والكحولية للسماق والقرفة كانت الأقهى في Yad على تثبيط نمو السلالات المختارة بمعدل 100 ملغم/مل. من ناحية أخرى، كان التركيز المثبط الأدنى لجسيمات الفضة النانوية 2000 مايكروغم / ملء بينما كان التركيز المثبط الأدنى لجسيمات 5102 TiO.، والبنتونيت النانوية 8000 مايكروغم / مل. تم اختبار دور التركيز تحت المثبط yl للمستخلصات النباتية و والجسيمات النانوية لتأثيرها ضد بعض الجينات المسؤلة عن الفوعة باستخدام تفاعل البلمرة الكمي اللحظي. أظهرت نتائجنا أن المستخلص المائي للسماق كان قادراً على تثبيط التعبير عن جميع الجينات التي تم اختبارهاء وهي flhD_s fIhB و 7554، و .20 Apms في 5 .2 . ومع cll فإن المستخلص المائي للقرفة لديه القدرة على خفض تنظيم اثنين من 1/18 flhD 5 في حين يزيد من التعبير عن -Apms zapA ،rsbA كانت البنتونيت فقط قادرة على aie التعبير عن flhB و ،flhD 554 و 2024 و apm تسببت جميع الجسيمات النانوية الأخرى قيد الدراسة في زيادة التعبير الجيني للجينات التي تم فحصها مقارنة بعينات التحكم غير المعالجة. تم اختيار العزلة البكتيرية التي أظهرت قدرة عالية على التجمع ونسبة مقاومة عالية للمضادات الحيوية لإجراء تسلسل البلازميدات الخاصة بها. تم إيداع التسلسل البلازميد الكامل P. mirabilis AD ud NCBI Global GenBank ..4 MoRay12 لأول مرة محليًا تحت اسم pPRM2023 ومنحه رقم تسلسلي 8 ا)اأظهر تحليل تسلسل pRM2023 أن حجم البلازميد المستعاد كان 8419 قاعدة نيتروجينية ويحمل الجينات المسؤولة عن مقاومة الأمينوغليكوزيد والأمينوسيكليتول والتتراسيكلين. تم اختيار جينوم العزلة البكتيرية التي أعطت أعلى نسبة مقاومة للمضادات الحيوية واحتوت على أكبر aac من جينات الفوعة لتسلسل الجينوم الكامل. يتكون جينوم Proteus mirabilis MORAY37 من 7 قاعدة نيتروجينية وتم إيداعه في DDBJ/ENA/GenBank تحت رقم تسلسلسي .NZ_JAWUZK000000000.1 كان إجمالي تسلسل ترميز البروتين 3844 ،CDSs وكان axe جينات الحمض النووي -RNA 75 cull حددت شجرة التصنيف التطوري ل Proteus mirabilis 7 باستخدام ald 5 أقرد ب سلالات النوع كانت Proteus mirabilis ATCC 6 . تظهر نتائج isDDH أن قيمة isDDH من Proteus mirabilis MORAY37 >789/: أعلى من الحد الأدنى، مقارنة بسلالة النوع 29906 ،Proteus mirabilis ATCC وهذا يشير مب _ حي Co id إلى أن تسلسلي الجينوم مرتبطان بقوة وينتميان إلى نفس النوع. تم التعرف على جينات مقاومة المضادات الحيوية المكتسبة من P. mirabilis MORAY37 في الجينوم باستخدام CARD أظهرت النتائج أن هناك حوالي 10 جينات في جينوم P. mirabilis MORAY37 تمنح مقاومة للأمينوغليكوزيدات والفلوروكينولونات والمونوياكتامات والسيفالوسبورين والكلورامفينيكول والسلفوناميدات.

A total of 37 Proteus mirabilis strains were isolated from 420 urine samples from patients attending several hospitals in Mosul / Iraq during the period (from December 2022 to April 2023). The isolates were identified based on cultural, microscopic, and biochemical testing, and were further confirmed by 16S rRNA gene sequencing. DNA sequences of 27 strains were submitted to the National Center for Biotechnology Information (NCBI) as new local strains belonging to P. mirabilis. Antibiotics susceptibility againsit 18 antibiotics showed that P. mirabilis was highly resistant towards amoxicillin (100%), followed by trimethoprim (97.29%), while low resistance rate were detected against ciprofloxacin and norfloxacin (13%), imipenem (8%) and meropenem (5%). Plasmid DNA analysis showed that 21 out of 37 P. mirabilis strains,21 strains contained plasmids, 2 strains contained two plasmids and 19 strains contained a single plasmid. Four groups of primers were used for PCR experiments. Group1 included primers used to identify six genetic regions, namely (CITM, DHAM, ACCM, EBCM, FOXM, MOXM1). Results showed that 85.71% of isolates carried FOXM on their plasmids and 14.28% carried MOXM and 4.76% carried CITM. However, DHAH, ACCM, and EBCM were not detected on plasmids.Group2 including zapA, ireA (siderophore receptor), hpmA (hemolysin) and mrpA, (fimbriae) genes. zapA was detected in 80.95% of P. mirabilis plasmids, followed by ireA at a rate of 76.19%, hpmA at 14.28%, and mrpA at 4.76%. Group 3 including CTXG1, CTXG2, CTXG9, CTXG8 and CTXG25. and its results showed that CTX9 was the highest gene detected, 76.19%, followed by CTXG1 71.42%, where as CTXG2, CTXG8, and CTXG25 were only detected on the chromosome. Finally, the pathogenic genes PmIJ1 and qnrD were found on P. mirabilis plasmids at 52.38% and 47.61%, respectively. The present results showed that plasmids are increasingly spread among clinical local isolates of P. mirabilis, and serious precautions are required. Eleven aqueous and alcoholic extracts from natural medical plants and four nanoparticles were tested for their inhibitory effect against P. mirabilis. Our results showed that the aqueous and alcoholic extracts of sumac and cinnamon was the strongest in their ability to inhibit the growth of selected strains at 100 mg/ml. On the other hand, MIC for silver nanoparticles was 2000 μg/ ml, while MIC was for SiO2, TiO2 and Bentonite NPs was 8000 μg/ ml. The role of sub-MIC of plant extracts and NPs was tested for their effect against some virulence and swarming related genes using quantitative PCR. Our results demonstrated that the aqueous extract of sumac was able to inhibit the expression of all genes tested, flhB, flhD, rsbA, zapA, and hpm, in P. mirabilis. However, the aqueous extract of cinnamon had the ability to down-regulate two flhB and flhD, Where as increasing the expression of rsbA, zapA, and hpm. Only Bentonite NPs was able to inhibit the expression of flhB, flhD, rsbA, zapA and hpm. All other nanoparticles under study caused an increase in gene expression for the genes examined compared to the untreated control samples. The bacterial isolate that showed high swarming capability and high rate of resistance to antibiotics understudy was selected for sequencing its plasmids. The complete plasmid sequence of the strain P. mirabilis MoRay12 was deposited at NCBI Global GenBank for the first time locally under the name pRM2023 and given the accession number CP135988. Sequence analysis of pRM2023 showed that the size of the plasmid recovered was 8419 bp and carried the genes responsible for aminoglycoside, aminocyclitol, and tetracycline resistance. The genome of the bacterial isolate that gave the highest percentage of resistance to antibiotics and contained the hughest number of virulence genes was chosen for whole genome sequencing. The genome of Proteus mirabilis MORAY37 consisted of 4,131,367 bp and was deposited at DDBJ/ENA/GenBank under the accession number NZ_JAWUZK000000000.1. The total protein-coding sequences (CDSs) was 3,844, and the number of RNA genes was 75. Phylogenetic taxonomy tree of Proteus mirabilis MORAY37 using TYGS server identified the closest type strains were Proteus mirabilis ATCC 29906. Results from isDDH shows that the isDDH value of Proteus mirabilis MORAY37 is ≥89%, above threshold-based, compared with the type strain Proteus mirabilis ATCC 29906, this indicates that the two genome sequences are strongly related and belong to the same species. Acquired antibiotic resistance genes from P. mirabilis MORAY37 have been identified in the genome using CARD. The results showed that there are about 10 genes in P. mirabilis MORAY37 genome conferring resistance to aminoglycosides, fluoroquinolones, monobactams, cephalosporins, chloramphenicol, and sulfonamides.

طلب نسخة من الملف

الملفات غير منشورة على الموقع. اترك بياناتك وسيتواصل معك موظفو قسم الشؤون الثقافية والفنون لإرسال النسخة مجاناً.

الاسم

رقم الهاتف

البريد الإلكتروني

الغرض من الطلب (اختياري)

إرسال الطلب